五、灭菌工艺的开发和验证

1， 两种灭菌方法
　　蒸汽-湿热灭菌工艺开发和应用，可采用两种方法：过度杀灭法（the overkill method）和生物负载法（the bioburden method）。生物负载法也可称为存活概率法。

1.1 过度杀灭法

　　工业上蒸汽灭菌周期的设定和应用，一般使用过度杀灭法（the overkill method）。使用过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证，而不管装载物的实际负载生物的数量多少和抗热性如何。假定生物负载的数量和耐热值设为如下水平：

N₀＝106
D₁₂₁＝1分钟
Z＝10℃

　　为了达到无菌保证水平SAL小于10^-6，NF＝10^-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的F_PHY和F_BIO如下：

F₀＝D₁₂₁×（LogN₀－Log N_F）＝12分钟

　　很少发现自然生成的微生物拥有超过0.5分钟的D₁₂₁值。过度杀灭法假设的生物负载数量和抵抗力都要高于实际。大多数微生物的耐热性都要比这低，因此能够提供很高程度的无菌保证。[separator]

　　即便采用蒸汽-湿热灭菌工艺为过度杀灭法（the overkill method），仍然需要对被灭菌产品的初始菌进行周期监测，并定期采用生物指示剂测试。

1.2 生物负载法

　　通常来说不耐热产品或物品的灭菌就不能使用过度杀灭法了。这就需要我们所建立的灭菌周期必须能恰当地杀灭微生物负载，但是不能导致不可接受的产品分解。这样的灭菌周期的建立就有赖于研究产品上的微生物数量和耐热能力。一旦微生物负载的数量和耐热能力得以明确，就可以设计出一个能达到SAL小于10^-6的灭菌周期。

　　按CGMP规范生产的产品实际生物负载数量应该是很低的，每个包装约在1～100CFU，对产品给予80～100℃下10～15分钟热休克，可以杀灭耐热值低的微生物。例如：

产品的生物负载测试中，测得：
N₀＝10²
D₁₂₁＝1分钟
Z＝10℃

　　则达到无菌保证水平SAL小于10^-6，NF＝10^-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的F_PHY和F_BIO如下：

F₀＝D₁₂₁×（LogN₀－Log N_F）＝8分钟

　　生物负载法需有实测产品活菌计数和耐热性筛选程序。必须取得足够的有关生物负载数据，亦建立历史资料。对生物负载筛选次数的要求，取决于历史资料的质量和变化情况，被灭菌产品的种类、生产工艺和灭菌工艺的类型等等。若生产环境发生了变化，应考虑对生物负载进行补充监测。

　　对生物负载耐热性的测定，可将含生物负载产品样本在推荐灭菌工艺下作分级递增暴露时间处理，然后进行无菌检查试验，以测定在不同的暴露时间内存活的菌量，或存在的阳性样本比例。作为一种替代方法，生物负载微生物的耐热性可通过分离和繁殖，随后接种在产品上或适当载体上进行测定。不过，要注意繁殖会改变生物负载的抗性。此外，还应对常规生物负载的微生物耐热性进行测定。

　　就生物负载而论，具有湿热高度耐热性的微生物菌株有：生胞梭菌（Clostridium sporogenes），凝结芽孢杆菌（Becillus coagulans），枯草芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌等。

　　以生物负载法为依据的灭菌工艺，需经常进行微生物筛选，以测定与产品有关的生物负载数量和种类。在常规生产中，应从每一种生产设备中抽取具有代表性的产品样本，并设计生物负载监测程序，对产品部件及生产中，包括环境和生产过程中，任何可明显地影响生物负载地变化进行评定。

2， 用于注射剂生产的辅助物料的灭菌工艺

　　用于注射剂生产的部分辅助物料在生产过程中与药品直接接触，因此同样需要灭菌。它们包括：过滤器、胶塞、胶管、服装、不锈钢器皿、填充机械部件、清洁用品等等。一般通过与饱和蒸汽直接接触而实现灭活，湿热蒸汽的能量通过传导或对流作用传递热量。常用方法是建立能够提供相同的最小灭菌保证水平的标准周期，再加上一定的安全系数，不管装载物的内容是什么。

　　对于这类物品，获得可重复和可预测无菌保证的最大障碍是物品中潜在的空气，所以适合的灭菌过程是先采用预真空过程，然后饱和蒸汽灭菌的方法。预真空过程的效果明显优于重力置换过程。

　　对于预真空灭菌程序，灭菌过程开始之前对装载物的处理是很重要的。如果每次的真空度为0.1个大气压，那么每个脉冲将使灭菌器内的空气减少90％或者1个对数单位。可以增加为三个真空脉冲（蒸汽注入高于大气压，以避免空气进入灭菌腔室），使装载物处于正常状态。通过这个方法，空气去除的效率会提高，平衡时间会缩短。

　　典型的重力置换程序建立在如下的理论基础上：腔室中的冷空气重于进入的蒸汽并且将沉降到腔室的底部。蒸汽进入腔室的时候，空气和冷凝液一起从腔室底部的蒸汽疏水阀排出。去除空气过程的成功取决于对蒸汽疏水阀的准确操作和合适的蒸汽分布。蒸汽一般通过导流板或多孔管注入灭菌器腔室，如果蒸汽增加得过于迅速或者没有合理分布，装载物的顶部附近可能会产生气穴，如果蒸汽增加得过于缓慢，空气可能会被加热而混入蒸汽中，从而使空气去除更加困难。重力置换去除空气的效率低于其他方法，不推荐用于空气去除困难的物品。

　　对于多孔/坚硬物品的灭菌，需要确定以下操作参数（但不仅限于此）：

　　若最后采用喷淋水降温，则必须监控喷淋水的质量。但是多孔/坚硬物质不适合采用喷淋水降温，一般采用抽真空或夹套降温。比如过滤器，胶塞，胶管，服装，不锈钢器皿，填充机械配件，清洁用品等等。

对于灭菌装载方式，需要注意以下几点：

 装载物的类型和结构要加以确认并记录在案；

 装载物不能接触到灭菌舱室内壁；

 金属箱表面与底座之间的接触应减小到最低程度，通常使用有孔的支架，必要时也可以用可调节的支架；

 为了便于空气去除，冷凝水排出和蒸汽穿透，要明确地确定装载物地方位并记录在案；

 质量大的装载物应放置在灭菌器中较低的架子上，以尽量减少被冷凝水弄湿；

 控制灭菌器中物品的数量，如果装载物的大小能够改变，则需要确定最小和最大的装载物，确认中间装载物的合理插入法应包括最低负载中的最难灭菌物品；

 如果确认研究表明物品的位置不影响灭菌效果，那么装载的形式可能是可变的；

 装载记录可以作为操作人员的参考。